Anaerobi su bakterije. Značajke anaerobnih uzoraka, klasifikacija i metode uzgoja

Najbogatija skupina organizama po broju i raznolikosti metaboličkih putova su prokarioti. Neki od njih koriste aerobnu shemu disanja tipičnu za većinu eukariota da sintetiziraju ATP (glavnu energetsku "valutu" stanice). Mikroorganizmi koji ne posjeduju ovaj mehanizam nazivaju se anaerobi. Ove bakterije su sposobne proizvesti energiju iz kemijskih spojeva bez kisika.

Anaerobna klasifikacija

U odnosu na kisik, razlikuju se dvije skupine anaerobnih bakterija:

• opcionalno - može primati energiju sa ili bez kisika, prijelaz s jedne vrste metabolizma na drugu ovisi o uvjetima okoline;
• obvezno - nikada ne koristite O ₂ .

Za fakultativne anaerobe, metabolizam bez kisika je od velike važnosti, a bakterije mu pristaju samo kao posljednje sredstvo, kada se ispuštaju u anaerobni okoliš. To se objašnjava činjenicom da je disanje kisika mnogo energetski korisnije.

U drugoj skupini anaerobnih stanica nedostaje biokemijski mehanizam upotrebe O ₂ za oksidaciju spojeva, a prisutnost tog elementa u okolišu nije samo korisna, nego i toksična.

Postoji nekoliko tipova obveznih anaerobnih vlakana koji se razlikuju po otpornosti na prisutnost molekularnog kisika:

• teška smrt čak i pri niskim koncentracijama O2;
• umjereno jaka karakterizirana srednjom ili visokom otpornošću na prisutnost kisika;
• Aerotolerant - posebna skupina prokariota koji ne samo da mogu preživjeti, nego i rasti u zraku.

Odnos određene bakterije prema kisiku može se odrediti prirodom njegovog rasta u debljini hranjivog medija.

Aero-tolerantni mikroorganizmi uključuju bakterije mliječne kiseline. Neke vrste (na primjer, Clostridium) mogu biti otporne na visoke koncentracije kisika zbog formiranja endospora.

Anaerobni energetski metabolizam

Svi anaerobi su tipični kemotrofi jer koriste energiju kemijskih veza kao izvor energije. U tom slučaju mogu biti i donatori energije organska tvar (kemoorganotrofija) i anorganska (kemolitotrofija).

Anaerobne bakterije imaju dvije vrste metabolizma bez kisika: disanje i fermentaciju. Temeljna razlika između njih leži u mehanizmu energetske asimilacije.

Tako se tijekom fermentacije energija najprije pohranjuje u fosfogenom obliku (na primjer, u obliku fosfoenolpiruvata), a zatim uz sudjelovanje citosolnih dehidrogenaza dolazi do fosfoliranja supstrata ADP. Elektroni se prenose u endogeni ili egzogeni akceptor, koji postaje nusprodukt procesa.

U respiratornom tipu metabolizma, energija se pohranjuje u specifičnom spoju - Pmf, koji se ili odmah koristi za stanične procese, ili se dovodi u membranski centrirani električni transportni lanac, gdje se ATP sintetizira. Samo, za razliku od aerobnog disanja, konačni akceptor elektrona nije kisik, nego drugi spoj, koji može biti i organske i anorganske prirode.

Vrste anaerobnog daha

Glavni zadatak koji rješava anaerobna bakterija s tipom respiratornog metabolizma je pronaći alternativu molekularnom kisiku. Energetski ishod reakcije ovisi o tome. Ovisno o tvari koja djeluje kao terminalni akceptor, postoje sljedeći tipovi anaerobnog disanja:

• nitrat;
• željezo;
• fumarat;
• sulfat;
• sumpor;
• karbonat.

Anaerobna respiracija je manje djelotvorna od aerobnog disanja, ali u usporedbi s fermentacijom ona daje mnogo veću potrošnju energije.

Anaerobna destruktivna bakterijska zajednica

Ova vrsta mikrobiote formirana je u ekološkim ekološkim nišama u kojima se gotovo u potpunosti troši kisik (poplavljena tla, podzemni hidraulički sustavi, muljeviti sedimenti itd.). Ovdje se radi o postupnoj degradaciji organskih spojeva, koju provode dvije skupine bakterija:

• primarni anaerobi odgovorni su za prvu fazu organske de-stimulacije;
• sekundarni anaerobi su mikroorganizmi s respiratornim metabolizmom.

Među primarnim anaerobima razlikuju se hidrolizi i disipotrofi, koji su međusobno povezani trofičkim interakcijama. Hidrolizi formiraju biofilmove na površini čvrstih supstrata i proizvode hidrolitičke egzoenzime koji razgrađuju složene organske spojeve u oligomere i monomere.

Nastali hranjivi supstrat primarno koriste sami hidroliti, ali i disipotrofi. Potonji su obično manje kooperativni i ne emitiraju značajne količine egzoenzima, apsorbirajući gotove produkte hidrolize biopolimera. Tipičan predstavnik disipotropa su bakterije roda Syntrophomonas.

uzgoj

Posebni zahtjevi za uzgoj se primjenjuju samo na obvezne anaerobne bakterije. Opcionalno se razmnožava u kisikovom okruženju.

Metode uzgoja anaerobnih mikroorganizama spadaju u tri kategorije: kemijske, fizikalne i biološke. Njihov glavni zadatak je smanjiti ili potpuno eliminirati prisutnost kisika u hranjivom mediju. Stupanj dopuštene koncentracije O2 određen je razinom tolerancije specifičnog anaerobnog.

Fizičke metode

Suština fizičkih metoda je uklanjanje kisika iz zraka, koji je u kontaktu s kulturom, ili potpuno eliminirati kontakt bakterija s zrakom. Ova skupina uključuje sljedeće tehnologije uzgoja:

• raste u mikro aerostatu - posebnom uređaju u kojem se umjesto atmosferskog zraka stvara umjetna mješavina plina;
• duboka kultivacija - sadnja bakterija ne na površini, već u visokom sloju ili u debljini medija tako da zrak ne prodire tamo;
• korištenje viskoznih medija u kojima se difuzija O2 smanjuje s povećanjem gustoće;
• raste u anaerobnoj posudi;
• punjenje površine vazelinskim uljem ili parafinom;
• upotreba CO ₂ inkubatora;
• korištenje anaerobne stanice SIMPLICITY 888 (najmodernija metoda).

Obvezni dio fizikalnih metoda je pred-ključanje hranjivog medija kako bi se uklonio molekularni kisik iz njega.

Korištenje kemikalija

Kemijski spojevi koji se koriste za uzgoj anaeroba podijeljeni su u 2 skupine:

• Čistači kisika adsorbiraju O ₂ molekule, a apsorpcijski kapacitet ovisi o vrsti tvari i količini zračnog prostora u okolišu. Najčešće se upotrebljavaju pirogalol (alkalna otopina), metalno željezo, monovalentni bakreni klorid, natrijev ditionit.
• Redukcijska sredstva (cistein, ditiotreitol, askorbinska kiselina, itd.) Smanjuju oksidacijsko-redukcijski potencijal medija.

Posebna vrsta kemijskih metoda je upotreba sustava za generiranje plina, koji uključuju agense koji generiraju vodik i ugljični dioksid, a O2 apsorbira paladijski katalizator. Takvi se sustavi koriste u zatvorenim spremnicima za uzgoj (anaerostats, plastične vrećice, itd.).

Biološke metode

Biološke metode uključuju zajedničko uzgoj anaeroba i aerobova. Potonji uklanjaju kisik iz okoline, stvarajući uvjete za rast njihovih “partnera”. Također se mogu koristiti anaerobne bakterije kao sorbirajuća sredstva.

Postoje dvije modifikacije ove metode:

• Posijati dvije kulture na različite polovice petrijeve zdjelice, koja se zatim zatvara poklopcem.
• Sjetva pomoću "satnog stakla" koji sadrži medij s aerobnom bakterijom. Tako staklo pokriva Petrijevu posudu, kontinuirani sloj posijan anaerobnom kulturom.

Ponekad se aerobni mikroorganizmi koriste u fazi pripreme tekućeg hranjivog medija za inokulaciju anaeroba. Nakon uklanjanja zaostalog kisika, aerobi (na primjer, E. colli) se ubijaju zagrijavanjem, a zatim se zasije željena kultura.

Izolacija čiste kulture

Čista kultura je populacija mikroorganizama koji pripadaju istoj vrsti, imaju ista svojstva i dobivena su iz jedne stanice. Kako bi se dobila skupina bakterija s takvim karakteristikama, obično se upotrebljavaju metode razrjeđivanja i ograničavajućih razrjeđenja, ali rad s anaerobima je poseban proces koji zahtijeva isključivanje kontakta s kisikom pri dobivanju izoliranih kolonija.

Postoji nekoliko načina za izoliranje čiste anaerobne kulture. To uključuje:

• Zeissler-ovom metodom sije se udar proreda u Petrijeve posude uz stvaranje anaerobnih uvjeta i naknadnu inkubaciju u termostatu (od 24 do 72 sata).
• Weinbergova metoda - dodjela anaeroba u kulturu primjenom šećernog agara (sjetva visokog stupca), bakterije se prenose zatvorenom kapilarom. Prvo, materijal se stavlja u epruvetu s izotoničnom otopinom (korak razrjeđenja), zatim u epruvetu s agarom koji ima temperaturu od 40-45 stupnjeva, pri čemu se temeljito miješa s medijem. Nakon toga, sukcesivni prijenosi se provode u još dvije epruvete, od kojih se posljednja hladi pod mlazom vode.
• Peretzova metoda - materijal razrijeđen u izotoničnoj otopini ulijeva se u Petrijevu posudu tako da ispunjava prostor ispod staklene ploče na dnu, na kojem treba započeti rast.

U sve tri metode, materijal iz dobivenih izoliranih kolonija se prenosi u medij za kontrolu sterilnosti (SCS) ili Kitt-Tarozzi medij.